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Baseia-se na demonstração de formas amastigotas do parasita por intermédio da coloração de Wright-Giemsa a partir de amostras de produtos biológicos, salientando-se o aspirado medular como o meio de eleição na doença visceral. No entanto, as biopsias em cutânea, ganglionar ou intestinal podem permitir a demonstração de parasitas em doentes com evolução menos típica. A cultura dos produtos em meio de Novy-McNeal-Nicole (NNN) permite o crescimento das formas amastigotas. embora este possa ser lento, devendo a cultura ser mantida até às 4 semanas. A serologia pode apoiar o diagnóstico de leishmaniose visceral se revelar títulos elevados do parasita, mas a resposta humoral pode ser rara ou inexistente em doentes com disfunção imunitária grave, pelo que a sua negatividade não exclui o diagnóstico nesta população. Do mesmo modo, novos testes de diagnóstico com elevada sensibilidade e especificidade, como ELISA para a proteína recombinante K39, não estão validados na população infectada por VIH.

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